تاثیر ترکیب محیط کشت (تنظیم کننده های رشد گیاه م مواد معدنی) بر سرعت تکثیر، طول ساقه، کالوس زایی و ریشه زایی پایه های M9، M27 و M106 بر اساس روش  Murashing and Stook مورد بررسی قرار گرفت. سرعت تکثیر اساسا بستگی به نو تنظیم کننده های رشد، کنسانتره های معدنی و ژنوتیپ داشت. بهترین تولید شاخه ها از نظر کمیت و کیفیت زمانی بود که µm 4.4 BA و µm 2.7 TDZ طی فاز تکثیر بود. اما برای ازدیاد طول ساقه برای همه ژنوتیپ ها 8.8 µm BA +1.14 µm TDZ + 2.8 µm GA3 بهتر بود. بیشترین میزان تکثیر (5.7) و بیشترین میزان وزن تر (2.25) و بیشترین میزان رشد توسط 4.4 µm BA و 2.7 µm TDZ برای M27 به دست آمد. پتانسیل ریزازدیادی M29 از سایر ژنوتیپ ها بیشتر بود. MM106 کمترین سرعت تکثیر را داشت (0.7 در ماه) وقتی 0 µm BA و 9.08 µm TDZ به کار برده شد. بهترین نتیجه برای ریشه زایی در محیط کشت نیمه سخت MS، 5.4 µm IBA و 1.2 µm توفوردی به دست آمد. بیشترین درصد ریشه دهی (64%) برای MM106 و کمترین (11%) برای M7 بعد از 3 ماه بود. تشکیل ریشه با کاهش عصاره سیتوکینین و افزایش IBA افزایش یافت اما درصد ریشه زایی بافت در محیط کشت  1/2X MS به طور معنی داری بیشتر از محیط کشت 2X MS بود.

کلمات کلیدی: پایه های رویشی سیب، ترکیب محیط کشت، سرعت تکثیر، تنظیم کننده های رشد گیاه.

مقدمه

تحقیقات در مورد ریز ازدیادی پایه های رویشی سیب سبب شده است که مشکلاتی که در تکثیر سنتی وجود داشت برطرف شود و سرعت تکثیر بیشتر و گیاهان عاری از بیماری همراه با توجیه اقتصادی بیشتر تولید شود. مراحل مختلف ریز ازدیادی مانند تکثیر ساقه ها، ازدیاد طول ساقه، ریشه زایی و تکثیر ساقه ها و حتی تولید مثل با ترکیب محیط کشت در ارتباط هستند (Zimmerman and Debergh, 1991; Karp, 1995; Zhu et al.,2005). یک روش ریزازدیادی برای یک ژنوتیپ خاص در یک محیط کشت خاص را نمی توان برای ژنوتیپ های دیگر به کار برد (George and Debergh, 2008). نیازهای متفاوتی از نظر محیط کشت در بین واریته های مختلف وجود دارد. یک ژنوتیپ قوی با یک محیط کشت خوب از نظر ترکیب مواد برای تکثیر در ارتباط استو سطح مواد معدنی در محیط کشت MS بهترین تکثیر را در پی داشت با سرعت تکثیر 3.3 در M.seiboldii و 5.7 در C1907. هرچند در این مورد دو ژنوتیپ دیگر یعنی D2212 و H0801 نمک های QLبه طور معنی داری سرعت تکثیر بیشتری داشتند (3.3 و 3.9) و در دوتای دیگر. فرمولاسیون ترکیب مواد معدنی محیط کشت یک فرایند تجربی است. حتی مهم ترین کارهای محیط کشت MS تجربی بود و به سمت بهینه کردن ترکیب مواد محیط کشت برای رشد کالوس تنباکو بود. پیشرفت های بعدی مانند محیط کاشت چوبی (WPM) بر اساس همین کارهای قبلی بود (Lloyd and McCown, 1981). BA (بنزیل آمینو پورین) و TDZ (تی دیازارون) بیشتریت سیتوکینی هایی هستند که در تکثیر شاخه هاس سیب به کار برده شده اند و در مطالعات مختلف به کار برده شده اند (Yepas and Aldwinckle, 1994). اثرات مختلف BA در طی تکثیر شاخه ها سیب به منظور افزایش سودمندی تکثیر شاخه ها و جلوگیری اثرات جانبی BA مانند کاهش و سختی در ریشه زنی های بعدی (Webster and Jones, 1991). یا توکسیسیتی بعد از چند کشت (Warner avd Boe, 1980). تکثیر بهتر می تواند در MM106 زمانی به دست آید که BA در دوز 0.5 تا 1 µm به کار برده شود (De Klerk et al., 2001). بهرین میزان تتنظیم کننده های رشد در اولین فاز کشت بافت بستگی به ژنوتیپ دارد (Ziv and Halevy, 1983; Webster and Jones,1991; Wang et al., 1994; Hofer 1997) به عنوان مثال 22µm BA برای M26 (Welander, 1989)، Jork 9 (Pawlickiand Welander, 1994و (Modgil et al., 2005) MM106 بهترین مقدار بود. در حالی که بهترین مقدار BA برای Florina از 22.2 تا 44.4 µm بود (Bartish and Korkhovoi, 1997). بعضی محققان گزارش کرده اند که بهترین میزان BA برای پایه های رویشی سیب کمتر از 22 µm است. برای مثال بهترین غلظت BA برای سرعت تکثیر مفید Toscan, M9 و M25 8.8 µm (Chakrabarty et al., 2003) و برای Marubakaido 11µm (Camargo et al., 1998;(Schaefer et al., 2002 و برای Malling Greensleves (54% سرعت تکثیر و 1.8 شاخه در explants) 8.8 µm بود . در حالی که M26 عصاره غلیظ تری برای همان میزان سرعت تولید نیاز دارد (Ongjanov, 1988). غلظت بیشتر BA (31.1) برای Golden Delicious و Empira مناسب بود (Yepes and Aldwinckle, 1994). سودمندی انواع مختلف اکسین ها مانند IBA، IAA و NAA بر روی ریشه دهی6 واریته مختلف سیب توسط  Zimmeraman and Fordham, 1985 مورد بررسی قرار گرفت بر روی Golden Delicious, Gala, Royal red delicious  و Spur Mclntoch. تفاوت معنی داری در اثر اکسین های مختلف وجود نداشت. در سه رقم Mclntoch و Delicious و Spartan NAA نتیجه بهتری در ریشه دهی نسبت به IAA داشت. اثرات NAA بر روی ریشه دهی  در غلظت های 0.1 تا 33mm برای 21 روز  در M26، M27 و M111 و M9 مطالعه شد و پاسخ به ریشه دهی برای همه گونه ها متفاوت بود. (James and Thurbon, 1979, 1981; Zimmerman and Fordham, 1985; Webster and Jones, 1989; Modgil et al.,1999; Sharma et al., 2000).  69-59% موفقیت در ریشه دهی به دست آمد با کابرد غلظت 10µm NOA و IBA. بین NOA و IBA اثر متقابل وجود داشت (James and Thurbon, 1979).

هدف این پروژه بهینه سازی محیط کشت برای ریزازدیادی ژنوتیپ های مختلف سیب بود. ترکیبات مختلف BA، TDZ و اکسین ها (IBA, NAA, 2,4-D) و GA3 در تکثیر و ازدید طول شاخه ها و شکل گیری و تشکیل ریشه و کالوس مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش ها

مواد گیاهی: پایه های رویشی یکساله سیب M7، M9 و MM111 که در گلخانه نگهداری شده بودند به عنوان منبع مواد به کار برده شد. همه گیاهان به طور سطحی در 75 درجه سانتیگراد برای مدت 30 ثانیه استرلیزه شده و با آب سه بار استرلیزه شدند. سپس در محلول 0.1% Hgcl2 حاوی 2 تا 3 قطره تونین20 به مدت 60 دقیقه غوطه ور شدند. جوانه های استرلیزه شده در محیط کشت (تنها یا چندگانه) در اوایل بهار برای کشت منتقل شدند. محیط کشت شامل (2 µm BA و 1.5 µm IBA) بود. محیط کشت هر 30 روز یکبار به طور مشابه شکل دهی می شد.

محیط کشت و شرایط کشت: 4 آزمایش در این مطالعه انجام شد. به ترتیب در اولین آزمایش هدف گسترش شاخه ها با استفاده از ترکیبات مختلف تنظیم کننده های رشد BA، TDZ، IBA، NAA و 2,4-D با غلظت های مختلف 2/1، 1 و 2 بود Murashing and Stook, 1962  (جدول 1). بر اساس آزمایش 1، آزمایش دوم انجام شد که هدف آن بهینه کردن غلظت تنظیم کننده های رشد مخصوصا GA3 برای افزایش طول ساقه بود (جدول1).  در سومین آزمایش اثر متقابل تنظیم کننده های رشد بر روی رشد شاخه های کشت شده در غلظت های مختلف مواد معدنی (2/1، 1 و 2) محیط کشت بر روی ریشه زایی مورد بررسی قرار گرفت. در چهارمین آزمایش تاثیر ترکیب محیط شیمیایی بر روی کالوس زایی شاخه های پایه های سیب مطالعه شد. محیط کشت به کار رفته شامل نمک های محیط کشت Murashing and Stook بود. ویتامین ها 3%، ساکارز جامد شده با آگار 65% و 70% (Solaribo and Beijine, China). همه محیط های کشت قبل از قرار داده شدن در اتوکلاو 120 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با NKOH یا NHCL به pH 2±8/5 رسیدند. جزیات تیمارها و سرایط به کار برده شده در آزمایشات در جدول 1 نشان داده شده است. همه تنظیم کننده های رشد گیاه قبل از قرار داده شدن در اتوکلاو اضافه شدند. همه کشت ها در اتاق رشد و در دمای 2± 25 در 6و7 روز اول نگهداری شدند و سپس تحت یه دوره نوری 8/16 ساعته  شب/روز با میزان نور µm 50 بر متر مربع بر ثانیه توسط نور سفید فلورسانت قرار گرفتند.

افزایش طول و ازدیاد شاخه ها: کشت یکنواخت از اولین تا چهارمین کشت از حدود 2 تا 3 سانتی متری شاخه ها جدا شدند و سپس به محیط کشت تکثیر منتقل شدند. جزییات و شرایط به کار رفته در آزمایش در جدول 1 آورده شده است. سرعت متوسط تکثیر شاخه ها، مجموع وزن تازه، طول شاخه ها و تولید برگ بعد از 30 روز اندازه گیری شدند.

کالوس زایی و شکل گیری ریشه: شاخه های ایزوله شکل گرفته با طول 4-2 سانتی متر از محیط کشت از هر ژنوتیپ برداشت شدند و به محیط کشت مربوط به 3 عصاره مختلف انتقال داده شدند (2/1، 1 و 2). مطابق با جدول 1 هر محیط کشت با ترکیبات اکسین تکمیل شد. درصد ریشه زایی، تعداد ریشه ها، طول ریشه و درصد کالوس زایی بعد از 50 روز و بعد از اعمال تیمارها تعیین گردیدند.

آنالیزهای آماری و جمع آوری داده ها: آزمایش ها در قالب بلوک های کامل تصادفی انجام شد. 30 محیط کشت برای هر تیمار در نظر گرفته شد. آنالیزهای آماری توسط نرم افزار SAS و تجزیه واریانس توسط آزمون حداقل اختلاف معنی دار LSD انجام گرفت.

نتایج

نتایج نشان داد که سرعت تکثیر پایه های مختلف سیب به طور معنی داری بستگی به سیتوکینین ها دارد. کاربرد ترکیب BA و اکسین ها (NAA, IBA) در تکثیر شاخه ها به طور معنی داری بیشتر از دیگر تیمارها بود (جدول 2). تیمار بدون BA سرعت تکثیر کمتری در همه تیمارها داشت (جدول 2). BA تکثیر شاخه ها را در محدوده 2.2 تا 4.4 تحریک کرد اما افزایش بیشتر BA سرعت تکثیر را کاهش داد (شکل 1). کاربرد عصاره غلیظ اکسین (IBA, NAA, 2,4-D) تکثیر را کاهش و شاخه های کوتاه و ضخیم و نامطلوب تولید کرد. از طرف دیگر افزایش مواد معدنی به 2X سرعت تکثیر را افزایش داد. ژنوتیپ های مختلف پایه های رویشی توانایی های مختلفی در ریزازدیادی داشتند (شکل 2). MM106  در مقایسه با M27 شاخه های بیشتری تولید کرد. بیشترین سرعت رشد (2.86) در MM106 مشاهده شد که در محیط رشد 8.8 µm TDZ و 1.4 µm BA رشد کرده بود. کاربرد عصاره غلیظ تر 2.8 µm GA3شاخه های جانبی را در مقایسه با عاره رقیق تر (1.4 µm) افزایش داد (جدول 2). از طرف دیگر عصاره غلیظ تر سیتوکینین در طی تکثیر شاخه ها بعد از انتقال آنها به محیط کشت ریشه زایی از تکثیر آنها جلوگیری کرد (داده ها نشان داده نشده اند). رشد شاخه ، شکل گیری ریشه و تکثیر پایه ها بستگی به سطح مواد معدنی در محیط کشت داشت (جدول 4). بهترین رشد شاخه در عصاره 2X بود در حالی که بیشترین ریشه زایی در 1/2X بود. وزن بافت تازه هنگامی که عصاره مواد معدنی از کم به زیاد در طی 6 هفته افزوده شد، افزایش پیدا کرد (جدول 4). افزایش عصاره به 2X سرعت تکثیر را افزایش داد (5.9 Explant در ماه). طول شاخه ها 33.6 میلی متر ، وزن تر کل 4.6 g/jar و سطح برگ 3.1 عدد در explants. تفاوت ژنوتیپ ها باعث تفاوت در ریشه زایی شد و M9 در مقایسه با MM106 ریشه بیشتری تولید کرد (شکل 3). بیشترین درصد (64%) ریشه زنی در محیط کشت 1/2X MS+4.9 IBA+ 2.7 NAA برای ژنوتیپ MM106 و کمترین درصد (11%) برای M9 مشاهده شد (جدول 4). همچنین تعداد ریشه و طول ریشه هنگامی که محیط کشت قبلی شامل مقدار بیشتری IBA بود، کمتر بود.

بحث و نتیجه گیری

همه فاکتورها (تکثیر شاخه ها، طول شاخه ها، تولید برگ و میزان ریشه زایی) پایه های رویشی سیب به طور معنی داری تحت تاثیر ترکیبات محیط کشت قرار گرفتند. این موضوع توسط محققان دیگر مورد تایید قرار گرفته است (Lane and McDougald,1982 ; Caboni and Tonelli, 1999; Kovalchuk et al., 2009). در بیشترین کارهایی که بر روی شاخه های سیب انجام گرفته است BA به عنوان منبع اکسین در محدوده 0.5 تا 0.2 میلی گرم در لیتر به کار برده شده است (Baraldi et al., 1991;Marin et al., 1993; Yepes and Aldwinckle, 1994; Caboniet al., 2000; Sharma et al., 2000; De Klerk et al., 2001;Kausal et al., 2005). همان طور که نتایج ما نشان داد تکثیر شاخه های سیب بر اساس محیط کشت حاوی سیتوکینین ها مخصوصا BA، 4.4µ در محیط کشت بود. همچنین اکسین و GA3 در غلظت کم (جدول 2). می توان گفت که سرعت تکثیر ژنوتیپ ها توسط BA و کنسانتره های مواد  معدنی در مقایسه با سایر مواد شیمیایی بیشتر تحت تاثیر قرار میگیرند. اگرچه سرعت تکثیر ژنوتیپ ها در پاسخشان به BA در محیط کشت متفاوت بود. (Yepas and Aldwinkle, 1994) دریافتند که در سطح 2.2 میلی گرم در لیتر BA تعادل بین GA3 و IBA طول ساقه را تحت تاثیر قرار می دهد. وقتی سطح IBA از 0.01 به 1 میلی گرم در لیتر افزایش پیدا کند افزایش طول ساقه تحریک می شود اما تنها در حضور GA3.  این نتایج مطلوب ترین غلظت سیتوکینین برای فاز تکثیر شاخه ها را را 4.4 µm BA+ 2.7µm TDZ و مطلوب ترین عصاره اکسین ها برای تشکیل ریشه را 5.4 µm IBA+ 1.2µm 2,4-D در کمترین سطح مواد معدنی ½ X MS می باشد (جدول 2،3 و4). این برای سایر رقم ها نیز توسط  Walander 1985 و Marin et al, 1993 نیز گزارش شده است. جلوگیری از رشد شاخه با کاربرد بیشتر از 5.4µm BA مشاهده شد در حالی که بیشترین اثر از رشد بازماندن 65 میلی متر به وسیله GA3 اتفاق افتاد. یک همبستگی منفی بین طول شاخه و تعداد شاخه در همه ژنوتیپ ها وجود داشت (جدول 2). بیشترین سرعت تکثیر ساقه در غلظت 4.4 µm BA به دست آمد.

مقدار مطلوب IBA برای ریشه زایی به ژنوتیپ بستگی داشت. تاثیر ترکیب اکسین ها (NAA, IBA, 2,4-D) در ریشه زایی M9، M27، MM106 مشابه نبود. تاثیر IBA بر روی ریشه زایی بیشتر از سایر اکسین ها بود. مقدار IBA لازم برای زیشه زایی به زنوتیپ بستگی داشت (جدول 3) و در M9 کمتر از بقیه بود (De Klerk et al., 1999; Magyar-Tábori et al., 2002). James, 1983 توزیع IBA در پایه های سخت ریشه M9 و آسان ریشه (M27) را آزمایش کرد. او نتیجه گرفت که اختلاف ریشه زایی به متابولیسم IBA بستگی دارد تا اختلاف در توزیع و بالاروی آن. بعدها Alvarezetal, 1989 و Harbage and Stimart, 1996 به این نتیجه رسیدند که سطح اکسین به طور معنی داری در M9 نسبت به M26 بالاتر بود. در حالی که سطح IAA در نوک شاخه ها در هر دو ژنوتیپ قابل مقایسه بود (268 , 263.7 mg/fw) اما در برش های پایه و سطوح فاقد IAA، 2.8 بار در M26 نسبت به M9 بیشتر بود.

توانایی ریشه زایی در شرایط آزمایشگاه می تواند توسط محتوی هورمون موجود در محیط کشت ازدیاد تحت تاثیر قرار گیرد. پتانسیل ریشه زایی بین واریته ها متفاوت بود (جدول 3). می توان گفت ریشه زایی با توالی ریشه زایی در یک زمینه مشترک شده اند. نتایج می تواند برای اهداف تولید مثلی متغیر باشد. Lan and Dougald, 1982 پاسخ M27 و M9 و M26 و MM111 و Macspur را با غلظت های متفاوت 0.1، 0.33، 1، 3.3، 10 و 33 NAA مقایسه کردند و دریافتند که بهترین سطح NAA برای ریشه زایی بین واریته ها متفاوت بود. M27، M26 و Macspur بیشترین ریشه زایی را در 1µm داشتند در حالی که MM111 در 33µm NAA. اثر متقابل BA و IBA در تشکیل ریشه سیب به وسیله De klerk et al, 2001 گزارش شد. درصد ریشه زایی با BA در محیط کشت تغییر چندانی نکرد. توانایی ریشه زایی Redfuji تا 55% کاهش یافت زمانی که میزان BA در محیط کشت از 1 به 3 میلی گرم در لیتر افزایش یافت (Maygar-Tabori et al., 2002). توانایی ریشه زایی از 51% به 85% افزایش یافت هنگامی که محیط کشت شامل 1 میلی گرم در لیتر BA و 0.1 میلی گرم در لیتر IBA بود (Maygar-Tabori et al., 2002). وقتی سطح IBA 0.3 میلی گرم در لیتر در محیط کشت همراه با BA به کار برده شد تعداد ریشه در M26 نسبت به سطح کمتر IBA به تنهایی (0.1میلی گرم در لیتر) افزایش یافت Ricci et al., 2000. افزایش IBA از 0.15 به 15 تعداد ریشه را افزایش داد. Caboni et al., 2000 نشان داد که افزایش سطوح مواد معدنی و سیتوکینین ها در محیط کشت تشکیل ریشه را کاهش داد اما کالوس زایی را افزایش داد که این در جدول 4 نشان داد شده است. محیط کشت نمکی مثل B5 (Gamborg et al., 1968) و N6 (Chu, 1978) برای رشد کالوس مناسب تشخیص داده شدند (Caboni et al., 2000). اما این محیط کشت برای شرد ریشه های قطع شده و سایر ارگانیزم ها مناسی نیستند (George et al., 1987; Ozias-Akins and Vasil,1985). سایر فاکتورهای فیزیکی مانند رطوبت نسبی در لوله های کشت، اتیلن و دی اکسید کربن و کشت ریشه های قطع شده و میزان Co2 فاز گازی لوله ها می تواند مهم باشد و بر روی رشد شاخه ها و تکثیر آنها تاثیر گذار باشد (Hicks, 1987; Welander and Pawlicki, 1993; George and Davies, 2008).

جدول 1: محیط کشت و ترکیبات آنها که در تکثیر و تولید شاخه های جانبی و شاخه ها به کار برده شده است.

جدول 2: تاثیر ترکیب PGRs بر روی سرعت تکثیر. طول شاخه، وزن تر کل، و تولید سطح برگ پایه های رویشی سیب کشت شده در محیط کشت MS.

شکل 1: تاثیر غلظت BA بر تولید شاخه پایه های رویشی سیب در محیط کشت MS

شکل2: اختلاف توانایی تکثیر شاخه و ازدیاد طول شاخه  در نوتیپ های سیب در محیط کشت حاوی BA 4.4µm + TDZ 2.7 µm+ IBA 1 µm+ NAA 1.22 µm +GA3 µm 6 ماه پس از کشت.

شکل 3: اختلاف توانایی تشکیل ریشه و تعداد ریشه در ژنوتیپ های سیب که در محیط کشت ½ x MS حاوی IBA 4.9 µm+ NAA 2.7 µm رشد کردند. C4:M9 ، a4:M27 و b4:MM106.

+ نوشته شده در  یکشنبه ۱۸ دی ۱۳۹۰ساعت 17:12  توسط مهندس عمار رسولی سفیددری  |